High Performance Liquid Chromatograpy
(HPLC)
High Performance Liquid Chromatography atau HPLC atau biasa juga disebut dengan Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas
untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah
bidang, antara lain: farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan
industri-industri makanan. Kegunaan umum HPLC antara lain: pemisahan sejumlah
senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis; analisis ketidakmurnian (impurities); analisis senyawa-senyawa
tidak mudah menguap (non-volatil); penentuan molekul-molekul netral, ionik,
maupun zwitter ion; isolasi dan
pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah banyak,
dan dalam skala proses industri (Gandjar dan Rohman, 2008). Metode HPLC mempunyai
kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang
sensitif. Dengan teknologi ini, kromatografi cair dapat menghasilkan pemisahan
yang cepat dalam banyak hal, dengan keunggulan zat-zat yang tidak menguap atau
tidak tahan panas dapat dikromatografi tanpa penguraian atau tanpa perlu
membuat derivat yang dapat menguap (Depkes RI, 1995).
HPLC merupakan metode yang tidak
destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun
kuantitatif. Keterbatasan metode HPLC adalah untuk identifikasi senyawa,
kecuali jika HPLC dihubungkan dengan spektrofotometer massa (MS). Keterbatasan
lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit
diperoleh (Gandjar dan Rohman, 2008).
Cara Kerja HPLC
Kromatografi merupakan teknik yang mana
solut atau zat-zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi,
dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan
solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam.
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok yaitu: (1)
wadah fase gerak, (2) sistem penghantaran fase gerak, (3) alat untuk memasukkan
sampel, (4) kolom, (5) detektor, (6) wadah penampung buangan fase gerak, (7)
tabung penghubung, dan (8) suatu komputer atau integrator atau perekam (Gandjar
dan Rohman, 2008).
Mekanisme kromatografi terdiri atas 4
tipe yaitu adsorpsi, partisi, penukar ion, dan eksklusi ukuran. Kromatografi
adsorpsi didasarkan pada kondisi antara zat terlarut dan fase diam padat.
Umumnya eluen yang digunakan untuk kromatografi adsorpsi kurang polar dari fase
diam (fase normal). Kromatografi partisi melibatkan fase diam cair yang
bercampur dengan eluen. Sistem partisi dapat berupa fase normal (fase diam
lebih polar daripada eluen) atau kromatografi fase terbalik (fase diam kurang
polar daripada eluen). Kromatografi penukar ion melibatkan fase diam padat
dengan kelompok anionic atau kationik pada permukaan zat yang terlarut.
Kromatografi eksklusi ukuran melibatkan fase diam cair dengan ukuran pori yang
terkontrol. Pemisahan dilakukan berdasarkan ukuran molekul suatu zat, dimana
molekul berukuan besar akan mengalami elusi terlebih dahulu (Moffat dkk, 2011).
Wadah Fase
Gerak pada HPLC
Wadah fase gerak harus bersih dan inert. Wadah pelarut kosong ataupun
labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya
dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum
digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan
gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain
terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat
pembuatan pelarut untuk fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan
pelarut, bufer, dan reagen dengan kemurnian yang tinggi, dan lebih terpilih
lagi jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk HPLC berderajat HPLC (HPLC grade). Adanya pengotor dalam
reagen dapat menyebabkan gangguan pada system kromatografi. Adanya partikel
yang kecil dapat terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang sempit, sehingga
dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut.
Karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk
menghindari partikel-partikel kecil ini (Gandjar dan Rohman, 2008).
Fase Gerak
Pada HPLC
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri
atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan
dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh
polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen
sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar dari pada fase gerak),
kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara
untuk fase terbalik (fase diam kurang polar dari pada fase gerak), kemampuan
elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan
fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air
dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling
sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan
pelarut-pelarut jenis alkohol (Gandjar dan Rohman, 2008).
Pompa pada HPLC
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC
adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni :
pompa harus inert terhadap fase
gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat,
Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan
sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan
penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin
proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan,
dan bebas dari gangguan (Gandjar dan Rohman, 2008).
Penyuntikan
Sampel pada HPLC
Sampel-sampel cair dan larutan
disuntikkan secara langsung ke dalam fae gerak yang mengalir di bawah tekanan
menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat
dan katup Teflon yang dilengkapi dengan
keluk sampel (sample loop) internal
atau eksternal.
Pada saat pengisian sampel, sampel
digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada
saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk
sampel dan menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikan dengan keluk
sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1%. Penyuntik ini mudah digunakan untuk
otomatisasi dan sering digunakan untuk autosampler
pada HPLC (Gandjar dan Rohman, 2008).
Kolom pada HPLC
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom
konvensional dan kolom mikrobor. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang
utama dibanding dengan kolom konvensional yakni:
a.
Konsumsi fase gerak kolom
mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena
pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100 µL/menit)
b.
Adanya aliran fase gerak
yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan
spektrofotometer massa
c.
Sensitivitas kolom mikrobor
ditingkatkan karena solute lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat
bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Tabel Perbandingan antara kolom HPLC konvensional dan kolom mikrobor (Kealey dan Haines, 2002)
Parameter
|
Kolom Konvensional
|
Kolom Mikrobor
|
Tabung kolom
|
Stainless steel
Panjang 3, 10, 15, 20 dan 25 cm.
Diameter luar 0,25 inci
Diameter dalam 4,6 mm.
|
Stainless steel
Panjang 25 dan 50 cm
Diameter luar 0,25 inci
Diameter dalam 1 atau 2 mm
|
Fase diam
|
Porous, silika ukuran kecil, silika yang dimodifikasi secara
kimiawi (bonded phase), atau
polimer-polimer stiren/ divinil benzene.
Rata-rata diameter 3,5 atau 10 µm dengan kisaran sempit.
|
Porous, silika ukuran kecil, silika yang dimodifikasi secara
kimiawi (bonded phase), atau
polimer-polimer stiren/divinil benzene.
Rata-rata diameter partikel 3,5 atau 10 µm dengan kisaran ukuran
partikel yang sempit.
|
Tekanan operasional
|
500-3000 psi
(35-215 bar)
|
1000-5000 psi
(70-350 bar)
|
Fase gerak
|
Hidrokarbon + pelarut-pelarut terklorinasi atau alcohol untuk
fase normal. Untuk fase terbalik (reversed
phase) digunakan metanol atau asetonitril + air atau buffer.
Kecepatan alir: 1-3 mL/menit
|
Hidrokarbon + pelarut-pelarut terklorinasi atau alkohol untuk
fase normal. Untuk fase terbalik (reversed
phase) digunakan metanol atau asetonitril + air atau buffer.
Kecepatan alir: 10-100 µL/menit.
Modifikasi instrument
Sistem penghantaran pelarut yang mampu memberikan control aliran
dibawah 10 µL/menit.
Katup injeksi sampel bervolume kecil; sel detektor bervolume
kecil
|
Kinerja
|
Efisiensi meningkat dengan berkurangnya ukuran partikel fase
diam, akan tetapi umur kolom dengan ukuran partikel 3 µm lebih pendek.
|
Sangat efisien dan sensitif, akan tetapi lambat.
Konsumsi fase gerak hanya ¼ dari kolom konvensional
|
Meskipun demikian, dalam prakteknya kolom mikrobor ini tidak
setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin (Gandjar
dan Rohman, 2008).
Fase Diam pada
HPLC
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika
yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau
polimer-polimer stiren dan divinil benzene. Permukaan silika adalah polar dan sedikit
asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Oktadesil silika (ODS atau
C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu
memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran rendah, sedang, maupun tinggi.
Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang
polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai
pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan
memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan adanya kandungan air yang
digunakan (Gandjar dan Rohman, 2008).
Tabel Berbagai fase diam silika dan alumina yang beredar di
pasaran (Munson, 1981)
Jenis
|
Nama
|
Diameter ukuran partikel (µm)
|
Bentuk partikel
|
Luas permukaan (m2/g)00
|
Silika
|
µ-Porasil
|
10
|
Tak teratur
|
300
|
Lichrosorb-Si-60
|
5,10
|
Tak teratur
|
500
|
|
Partisil
|
5,10,20
|
Tak teratur
|
400
|
|
Micro Pak Si
|
5,10
|
Tak teratur
|
400
|
|
Sil-X-1
|
13 ± 5
|
Tak teratur
|
400
|
|
Porasil C
|
37-75
|
Bundar
|
50-100
|
|
Vydac HS
|
5,10,15,20
|
Bundar
|
300
|
|
Hypersil
|
5-7
|
Bundar
|
200
|
|
Nucleosil 50
|
5,10
|
Bundar
|
500
|
|
Sorbax Sil
|
6-8
|
Bundar
|
300
|
|
Spherisorb
|
5,10
|
Bundar
|
220
|
|
Alumina
|
Lichrosorb ALOX
|
5,10
|
Tak teratur
|
70
|
Micro Pal AL
|
5,10,20
|
Tak teratur
|
70
|
|
Spherisorb AY
|
5,10,20
|
Bundar
|
95
|
Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi
2 golongan yaitu : detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum,
tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif); dan golongan detektor
yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif.
Suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut (Gandjar
dan Rohman, 2008):
a.
Mempunyai respon terhadap
solut yang cepat dan reprodusibel
b.
Mempunyai sensitifitas yang
tinggi
c.
Stabil dalam
pengoperasiannya
d.
Mempunyai sel volume yang
kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
e.
Signal yang dihasilkan
berbanding lurus dengan konsentrasi
solute pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier)
f.
Tidak peka terhadap
perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak
Komputer,
Integrator, atau Rekorder
Tidak ada komentar:
Posting Komentar